葡聚糖凝膠柱的預(yù)處理、裝柱、加樣、洗脫收集與回收

 

   稱取Sephadex葡聚糖凝膠（50－100目）約5g，加入蒸餾水100ml，置室溫下3h進行溶脹。

 

2、葡聚糖凝膠柱的裝柱

 

   凝膠層析柱的直徑與柱長之比一般為1:15。柱的底部用裝有細玻璃管的橡皮塞塞緊，用洗凈的玻璃絲（約200目尼龍布）墊底或購買類似規(guī)格的商品柱。然后將柱垂直安裝好，先加入1/3柱體積蒸餾水，接著將溶脹好的凝膠邊攪勻邊連續(xù)裝入，使它們在柱內(nèi)自然沉降。同時大開下口慢速流出蒸餾水。裝柱后的凝膠必須均勻，不能有氣泡或明顯條紋。否則，必須到出重裝，裝好后，用蒸餾水平衡2－3h即可加樣品分離。

 

3、葡聚糖凝膠柱的加樣

 

加樣前，首先把柱內(nèi)凝膠上面多余的蒸餾水放出，直到柱內(nèi)液面與凝膠表面相齊（或留一極薄液層）為止。然后，由柱的上端加水解液2ml，注意不要讓溶液把凝膠沖松浮起，加完樣品后，打開下口緩慢放出液體至液面與凝膠面相齊，再用少量蒸餾水沖洗原來盛樣品的容器2－3次，待全部進入層析柱后，即可進行洗脫。

 

4、葡聚糖凝膠柱的洗脫與收集

 

洗脫時，用蒸餾水作洗脫劑，并且要連續(xù)不斷地進行，使凝膠柱上端保持一定的液層，防止凝膠柱表面的液體流干。本實驗洗脫液流出的速度應(yīng)控制在0.8－1.0ml/min。洗脫液的收集采用分管連續(xù)順序收集，每管收集3ml，共收集10管。據(jù)經(jīng)驗，4或5號管核苷酸濃度zui大，可作為層析鑒定的樣品液。但因?qū)游鲋L度的差異，管號會有變化，必要時可用紫外檢測A260nm，找出濃度zui大的管號。

 

5、凝膠的再生和回收

 

   葡聚糖凝膠柱使用一次后，必須反沖疏松一次，平衡后再使用。若使用數(shù)次，就需要再生處理。用0.1mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl溶液浸泡，然后用蒸餾水洗至中性備用。若實驗完畢，將再生后的凝膠在布氏漏斗上用蒸餾水洗滌抽干，再用95%乙醇洗兩次，在60℃烘箱中烘干，回收保存。