脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染DNA的操作過程

 　　脂質(zhì)體2000適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前條件下zui方便的轉(zhuǎn)染方法之一。轉(zhuǎn)染率高，優(yōu)于磷酸鈣法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各種細(xì)胞。

　　用脂質(zhì)體2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，首先需優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，應(yīng)找出該批LR對(duì)轉(zhuǎn)染某一特定細(xì)胞適合的用量、作用時(shí)間等，對(duì)每批LR都要做：先要固定一個(gè)DNA的量和DNA/LR混合物與細(xì)胞相互作用的時(shí)間，DNA可從1~5μg和孵育時(shí)間6小時(shí)開始，按這兩個(gè)參數(shù)繪出相應(yīng)LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩者*的劑量，確定出轉(zhuǎn)染時(shí)間(2~24小時(shí))。因LR對(duì)細(xì)胞有一定的毒性，轉(zhuǎn)染時(shí)間以不超過24小時(shí)為宜。

　　細(xì)胞種類：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一種細(xì)胞均可作為受體細(xì)胞。

　　快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作步驟如下：

　　(1)以5×105細(xì)胞/孔接種6孔板(或35mm培養(yǎng)皿)培養(yǎng)24小時(shí)，使其達(dá)到50~60%板底面積。

　　(2)在試管中配制DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物方法如下：

　　①在1mL無血清DMEM中稀釋PSV2-neo質(zhì)粒DNA或供體DNA。

　　②旋轉(zhuǎn)1秒鐘，再加入脂質(zhì)體懸液，旋轉(zhuǎn)。

　　③室溫下放置5~10分鐘，使DNA結(jié)合在脂質(zhì)體上。

　　(3)棄去細(xì)胞中的舊液，用1mL無血清DMEM洗細(xì)胞一次后棄去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物，37℃培養(yǎng)3~5小時(shí)。

　　(4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)14~24小時(shí)，

　　(5)吸出DMEM/DNA/脂質(zhì)體混合物加入新鮮10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培養(yǎng)24~48小時(shí)。

　　(6)用細(xì)胞刮或消化法收集細(xì)胞，以備分析鑒定。

　　穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法如下：

　　(1)接種細(xì)胞同前，細(xì)胞長(zhǎng)至50%板底面積可用于轉(zhuǎn)染。

　　(2)DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物制備轉(zhuǎn)染細(xì)胞同前(2)、(3)步驟。

　　(3)在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM，37℃培養(yǎng)48小時(shí)。

　　(4)吸出DMEM，用G418選擇培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞，使細(xì)胞生長(zhǎng)一定時(shí)間，篩選轉(zhuǎn)染克隆，方法參照細(xì)胞克隆篩選法進(jìn)行。

　　注：脂質(zhì)體，即lipofectin regeant，LR